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玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的净化过程以及结果判定详细描述
点击次数:156 发布时间:2020-12-16
  玉米赤霉烯酮(Zearaleaone)又称F-2毒素,是玉米赤霉菌的代谢产物,具有类雌激素样作用,具有较强的生殖毒性和致畸作用,可引起动物发生雌激素亢进症,导致动物不孕或流产,对家禽、猪、牛和羊的影响较大,给畜牧业带来很大的经济损失。
 
  玉米赤霉烯酮免疫亲和柱试验原理:
 
  本产品的测定的基础是抗原抗体反应,玉米赤霉烯酮单克隆抗体连接在柱内凝胶上,样品中的玉米赤霉烯酮经过提取、过滤、稀释,然后将样品提取液缓慢的通过玉米赤霉烯酮免疫亲和层析柱,在免疫亲和柱内,玉米赤霉烯酮与抗体结合,之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质。用甲醇洗脱玉米赤霉烯酮,然后注入到分析仪器中用于检测。
 
  玉米赤霉烯酮免疫亲和柱净化过程:
 
  1、3mL柱管取出上方堵头,减去上堵头螺纹下突出部分,插回柱子上(1mL柱管上方堵头取出后斜 剪断,然后再插回柱子上),另一端与20mL针筒固定后使用;
 
  2、准确移取上述混匀滤液,注入针筒中,调节针筒压力使其以2秒/滴的速度缓慢通过免疫亲和柱;
 
  3、用20mL 水冲洗柱子,流速1秒/滴,弃去流出液,直至2~3mL空气通过柱体,保证柱子内没有残余 液体;
 
  4、准确加入2mL甲醇(色谱级)洗脱,流速自然重力,直至2~3mL空气通过柱体,保证柱子内没有 残余液体。收集全部洗脱液;
 
  5、过有机滤膜(孔径0.22μm)后,进行HPLC测定;或用氮气吹干,经流动相复溶,过有机滤膜 (孔径0.22μm)后,参照GB 5009.209-2016或GB/T 28716-2012条件进行HPLC测定。
 
  结果判定:
 
  经玉米赤霉烯酮免疫亲和柱净化后,收集到的甲醇洗脱液可直接使用荧光计或者HPLC检测,也可使用薄层色谱或者酶联免疫试剂盒进行检测。收集到的1ml洗脱液中的玉米赤霉烯酮含量相当于1g样品中玉米赤霉烯酮含量。
 
  过程中的注意事项:
 
  1. 亲和柱使用前,需要提前平衡30min至室温;
 
  2. 亲和柱与20mL针筒连接时,一定旋紧20mL针筒与堵头连接处,防止上样过程漏液;
 
  3. 采用大量程移液器准确移取混匀滤液进行上样;样液流过柱体的速度不能过快,采用固相萃取架过柱 时可以调节流速为2秒/滴,若无此设备,自然重力流速也可;
 
  4. 冲洗柱子时保持自然重力流速即可;对于酱油、醋、油类、玉米加工副产物及饲料等颜色较深的样品, 可以先用10mL 0.1%吐温20-PBS清洗,再用10 mL 10%甲醇-水冲洗,后用10mL水冲洗柱子;
 
  5. 柱子冲洗过后一定要用洗耳球吹干柱子内残余的液体,但不能让柱子干燥时间过长,要立即加入洗脱 液;
 
  6. 采用玻璃移液管准确移取2mL色谱级甲醇进行洗脱,自然重力流速即可(不可施压),后一定要用 洗耳球吹干柱子内残余的甲醇,收集全部洗脱液;
 
  7. 洗脱液必需先经过0.22μm滤膜过滤才能进行HPLC测定;
 
  8. HPLC测定值接近高检出值时,样本实际含量可能大于柱容量而造成流穿,需减少上样体积。
 
  适用范围及性能:
 
  用于定量检测谷物、酒类等食品和饲料等样本中的玉米赤霉烯酮时的样品前处理。
 
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